Vaccino mRNA Covid-19

Riprendiamo un articolo apparso sul Journal of Hepatology a firma di

Focus

  • Identificazione di correlati immunitari in un caso di epatite autoimmune associata al vaccino mRNA
  • La citometria di massa per immagini identifica l’arricchimento panlobulare intraepatico delle cellule T CD8 citotossiche attivate
  • La citometria a flusso identifica l’arricchimento intraepatico delle cellule T CD8 attivate con specificità SARS-CoV-2
  • L’attivazione periferica delle cellule T CD8 specifiche per SARS-CoV-2 è correlata ai livelli di ALT

Sommario

Background & Obiettivi

Episodi di epatite autoimmune sono stati descritti in seguito all’infezione da SARS-CoV-2 e alla vaccinazione, ma la loro fisiopatologia rimane poco chiara. Qui, riportiamo il caso di un maschio di 52 anni, che presenta episodi bimodali di epatite acuta, ciascuno dei quali si verifica 2-3 settimane dopo la vaccinazione a mRNA BNT162b2 e ha cercato di identificare i correlati immunitari sottostanti. Il paziente ha ricevuto la prima budesonide orale, recidiva, ma ha raggiunto la remissione sotto steroidi sistemici.

Metodi

La citometria di massa di imaging per il profilo immunitario spaziale è stata eseguita sul tessuto bioptico epatico. La citometria a flusso è stata eseguita per sezionare i fenotipi delle cellule T CD8 e identificare longitudinalmente le cellule T specifiche di SARS-CoV-2 e EBV-specifiche. Gli anticorpi indotti dal vaccino sono stati determinati da ELISA. I dati sono stati correlati con i laboratori clinici.

Risultati

L’analisi del tessuto epatico ha rivelato un infiltrato immunitario quantitativamente dominato da cellule T CD8 citotossiche attivate con distribuzione panlobulare. È stato inoltre osservato un arricchimento di cellule T CD4, cellule B, plasmacellule e cellule mieloidi rispetto ai controlli. L’infiltrato intraepatico ha mostrato arricchimento per le cellule T CD8 con specificità SARS-CoV-2 rispetto al sangue periferico. In particolare, la gravità dell’epatite è correlata longitudinalmente con un fenotipo citotossico attivato di cellule T CD8+ periferiche sars-CoV-2-specifiche, ma non di cellule T CD8+ specifiche per EBV o immunoglobuline indotte da vaccino.

Conclusioni

La vaccinazione COVID19 può suscitare una distinta epatite immuno-mediata dominante sulle cellule T con un meccanismo patologico unico associato all’immunità residente in tessuto antigene-specifico indotta dalla vaccinazione che richiede immunosoppressione sistemica.

Riassunto laico

L’infiammazione del fegato è osservata durante l’infezione da SARS-CoV-2, ma può verificarsi anche in alcuni individui dopo la vaccinazione e condivide alcune caratteristiche tipiche con la malattia epatica autoimmune. In questo rapporto, mostriamo che le cellule T altamente attivate si accumulano e sono distribuite uniformemente nelle diverse aree del fegato in un paziente con infiammazione del fegato dopo la vaccinazione SARS-CoV-2. Inoltre, all’interno di queste cellule T infiltranti nel fegato, abbiamo osservato un arricchimento delle cellule T che sono reattive al SARS-CoV-2, suggerendo che queste cellule indotte dal vaccino possono contribuire all’infiammazione del fegato in questo contesto.
 

Sommario grafico

Introduzione

La vaccinazione è la strategia chiave per combattere la pandemia globale di COVID19. Non c’è stato alcun segnale di sicurezza dell’epatite negli studi di vaccinazione COVID19[[1]], tuttavia diversi rapporti hanno recentemente associato condizioni simili all’epatite autoimmune (AIH) con i vaccini COVID19[234567891011]. Per quanto ne sappiamo, non è stato riportato alcun caso grave di insufficienza epatica che richieda un trapianto di fegato. Il danno epatico è stato osservato dopo entrambi i vaccini a base di mRNA e vettori, mentre il tempo dalla somministrazione del vaccino all’insorgenza dei sintomi variava tra 4 giorni dopo la prima dose e 6 settimane dopo la seconda dose. Un paziente è stato riesposto al vaccino che ha portato ad un peggioramento del danno epatico.[11]]. Non è chiaro se l’associazione riportata dell’epatite autoimmune con la vaccinazione sia casuale, possa riflettere un danno epatico transitorio indotto da farmaci o possa comportare un’attivazione immunitaria antigene-specifica indotta da SARS-CoV-2.[12]]. Tuttavia, il fatto che le condizioni simili all’AIH si siano verificate anche dopo l’infezione da SARS-CoV-2 [[13]] suggerisce che quest’ultimo potrebbe essere un fattore trainante per i casi sporadici.Qui, descriviamo il caso di un maschio di 52 anni che presenta epatite epatocellulare/colestatica mista acuta dopo la prima dose di vaccino a mRNA BNT162b2 e epatite grave dopo la seconda dose. La valutazione diagnostica era compatibile con i criteri per l’epatite autoimmune (AIH). Dopo l’inizio della terapia orale con budesonide, i test di funzionalità epatica sono migliorati per un mese prima che si verificasse una recidiva che è stata trattata con successo con prednisolone sistemico e acido ursodesossicolico. Una valutazione immunologica completa degli infiltrati infiammatori nel fegato ha rivelato la presenza di un infiltrato citotossico di cellule T CD8 altamente attivato, tra cui una popolazione di cellule T CD8 specifiche per SARS-CoV-2 correlata all’attivazione periferica delle cellule T CD8 specifiche di SARS-CoV-2, indicando che l’epatite da vaccinazione post-COVID19 comporta risposte immunitarie antigene-specifiche suscitate dalla vaccinazione con caratteristiche istologiche distinte rispetto all’epatite autoimmune in buona fede.

Corso clinico

Il paziente di sesso maschile di 52 anni senza una storia medica notevole diversa dall’ipotiroidismo preesistente in terapia sostitutiva a lungo termine con levotiroxina e test di funzionalità epatica storici normali (LFT) ha sviluppato nausea progressiva, affaticamento, perdita di appetito e prurito con sintomi a partire da circa 10 giorni dopo la prima dose (primaria) del vaccino mRNA BNT162b2. Successivamente ha sviluppato ittero e ha presentato al suo medico di base con LFT indicativo di epatite epatocellulare / colestatica mista acuta (ALT: 2130 U / l, AP: 142 U / l gamma-GT: 217 U / l, Bilirubina 7,7 mg / dl) (Fig. 1). Il paziente è stato ricoverato in un centro di assistenza primaria 25 giorni dopo la prima vaccinazione. L’epatite virale A, B, C ed E, nonché le infezioni da citomegalovirus e virus di Epstein-Barr sono state escluse dai test sierologici e/o PCR. La genotipizzazione dell’HFE non ha rivelato variazioni associate all’emocromatosi. Non c’è stato nemmeno un consumo significativo di alcol e la sierologia autoimmune è rimasta inconcludente con la reattività borderline di AMA-M2. Il paziente si è ripreso rapidamente senza terapia specifica ed è stato dimesso con LFT decrescenti dopo tre giorni sotto la principale diagnosi differenziale di epatite tossica. Nelle due settimane successive, gli enzimi epatici diminuirono ulteriormente, con la normalizzazione di AST e AP e il paziente ricevette la sua seconda dose (boost) del vaccino mRNA BNT162b2 41 giorni dopo la prima vaccinazione (Fig. 1). 20 giorni dopo la vaccinazione boost (dpb), il paziente ha ri-sperimentato nausea e affaticamento. I test di laboratorio hanno rivelato una ricaduta di epatite mista acuta con (ALT 1939 U / l, ALP 167 U / l, bilirubina 2,9 mg / dl). Successivamente è stato indirizzato al nostro centro terziario a 26dpb. La sierologia autoimmune è stata ripetuta con iperglobulinemia lieve (livelli di IgG 1,02 volte superiori a ULN, livelli normali di IgA e IgM), ANA (1:200) e positività borderline per anticorpi anti-muscolo liscio e AMA-M2 mentre i test per anti-LKM sono rimasti negativi. Abbiamo eseguito una biopsia epatica che istologicamente ha mostrato l’interfaccia dell’epatite con un moderato grado di infiltrato linfoplasmacitico e focolai di necrosi lobulare e apoptosi. I granulociti eosinofili non erano presenti. Non sono state osservate né fibrosi perisinusoidale né portale rilevante. Insieme, questi risultati sono compatibili con una probabile epatite autoimmune secondo il punteggio originale rivisto per l’epatite autoimmune.[14]] e il paziente è stato trattato con 9 mg di budesonide orale al giorno. Nelle settimane successive gli enzimi epatici sono diminuiti prima che si verificasse una ricaduta 39 giorni dopo l’inizio della terapia (66 dpb), che è stata controllata successivamente dopo l’escalation della terapia a steroidi sistemici in combinazione con acido ursodesossicolico. Le LFT del paziente si sono successivamente normalizzate entro 8 settimane (Fig. 1). Gli anticorpi anti-spike non hanno mostrato fluttuazioni maggiori con titoli simili rispetto agli individui sani al momento della diagnosi a 27 giorni dopo la vaccinazione boost (Fig. 1B) e una riduzione attesa dei titoli nel tempo (Fig 1C).

Figura 1Corso clinico con epatite dopo vaccinazione BNT162b2. A: Decorso temporale dei livelli di ALT, AST, ALP, gamma-GT e bilirubina dopo la vaccinazione BNT162b2 nel paziente. Le frecce indicano il timepoint di BNT162b2 prime e aumentano la vaccinazione. Le punte di freccia indicano il punto temporale della biopsia epatica. La durata e la dose della terapia con budesonide (9 mg/d) e prednisolone (inizialmente 50 mg/die) sono indicate nella colorazione arancione e rossa. B: Confronto tra i titoli anticorpali anti-spike S1 IgG nel paziente con i vaccini abbinati al timepoint che non hanno sviluppato l’epatite. C: Analisi longitudinale degli anticorpi anti-spike S1 IgG prima e dopo l’inizio della terapia.

Risultati

 Analisi immunitaria spaziale profonda del tessuto epatico

Per comprendere l’infiltrato immunitario nel fegato in modo più dettagliato, oltre all’istochimica convenzionale, abbiamo eseguito una citometria di massa per immagini altamente multiplexata con un ampio pannello che copre le popolazioni immunitarie rilevanti. Come mostrato in figura 2A, questo ha rivelato infiltrati costituiti da cellule T, macrofagi, cellule B, plasmacellule e granulociti nel fegato. Il numero assoluto di cellule immunitarie è aumentato di 5,3 volte rispetto al tessuto epatico di controllo non malato ottenuto da resezioni epatiche (Fig. 2B). È interessante notare che, tra gli infiltrati immunitari, le cellule T CD8 rappresentavano il sottoinsieme di cellule immunitarie più abbondante (465 per mm).2), che era inaspettato per AIH. Al contrario, le cellule B e le plasmacellule che sono tipicamente arricchite in AIH, sono state trovate a numeri relativamente bassi (102 per mm2 e 66 per mm2 rispettivamente), anche se queste popolazioni sono state arricchite anche nell’infiltrato immunitario rispetto ai controlli (Fig. 2E). Questi risultati hanno suggerito un diverso contributo delle cellule immunitarie rispetto alla tipica AIH spontanea. Successivamente abbiamo valutato la localizzazione spaziale dei diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie all’interno del parenchima epatico. L’infiltrazione immunitaria più forte è stata osservata nelle aree periportali (Fig. 2C). In particolare, mentre anche le cellule B e le plasmacellule erano arricchite ma prevalentemente presenti nelle aree periportali, la distribuzione delle cellule T CD8 era panlobulare (Fig. 2C, D). Per testare i correlati immunitari del danno epatico, abbiamo valutato il marcatore del granulo citotossico Granzyme B. È interessante notare che abbiamo osservato un forte accumulo di cellule T CD8 citotossiche (Granzyme B-positive) mentre altri sottoinsiemi di cellule immunitarie che esprimono Granzyme B, come i granulociti, non sono aumentati (Fig. 2E). Questi dati sono anche in linea con la nostra osservazione di una maggiore espressione intraepatica di CD38, HLA-DR e fattore di trascrizione T-bet come marcatori di cellule T effettrici attivate (Fig. 2A, F). Sulla base del loro forte arricchimento, della distribuzione ampiamente diffusa e del fenotipo citotossico attivato all’interno del parenchima epatico, abbiamo ipotizzato che le cellule T CD8 potrebbero essere i driver dell’infiammazione epatica.
Figura 2La profonda analisi spaziale dell’ambiente immunitario epatico rivela l’infiltrazione immunitaria dominata dalle cellule T CD8 citotossiche. La biopsia epatica è stata analizzata mediante citometria di massa (IMC) per immagini altamente multiplexed. A: Immagini IMC pseudocolori della biopsia epatica. In alto a sinistra: la visualizzazione composita di CD45, CK7, CD34, LYVE1, a-SMA e DNA sono indicate dai colori come indicato. La visualizzazione a marcatore singolo viene visualizzata per i marcatori rappresentati sul bordo sinistro delle visualizzazioni. Una regione di interesse è indicata dalla casella e dettagliata a risoluzione più elevata. La barra della scala indica rispettivamente 500 μm e 100 μm negli inserti. B: I conteggi cellulari dei sottoinsiemi di cellule immunitarie nel fegato sono mostrati come grafici a barre impilati rispetto ai controlli. C: Immagine IMC composita che visualizza esempi di zone epatiche definite da marcatori strutturali: zone periportali (in alto), intermedie (al centro) e centrilobulari (in basso). Conteggi delle cellule immunitarie all’interno delle regioni definite visualizzate come grafici a barre impilati accanto ai rispettivi inserti. La barra della scala indica rispettivamente 200 μm e 100 μm negli inserti. D: L’arricchimento delle popolazioni immunitarie indicate è stato calcolato dividendo la densità cellulare nel campione del paziente per mezzo dei campioni di controllo. E: Distribuzione della conta positiva delle cellule T CD8 e dei granulociti granzima B (GrzB) all’interno delle zone epatiche. F: La frequenza (a sinistra) e la densità cellulare (a destra) delle cellule T HLA-DR+ CD38+ CD8 sono mostrate per il paziente con epatite e i controlli.

 Immunofenotipizzazione periferica intraepatica e longitudinale delle risposte delle cellule T CD8 associate alla vaccinazione

Successivamente abbiamo eseguito un’analisi dettagliata delle popolazioni intraepatiche e periferiche di cellule T CD8 utilizzando la citometria a flusso. La popolazione intraepatica di cellule T CD8 del paziente è stata arricchita per i marcatori di residenza tissutale (CXCR6, CD69 e CD103) e di attivazione (CD38) (Fig. 3A). L’espressione di CD38 sulle cellule T CD8 è stata osservata anche nel sangue periferico. È interessante notare che i livelli di espressione di CD38 erano marcatamente elevati nel paziente rispetto ai vaccinati di controllo post-vaccinazione che non hanno sviluppato epatite (75,9% vs 15,4%, rispettivamente) (Fig. 3B). L’insolita espansione delle cellule T citotossiche attivate osservata nella nostra analisi spaziale ci ha portato a ipotizzare che le cellule T CD8 spike-specifiche SARS-CoV-2 indotte dalla vaccinazione potrebbero contribuire alla malattia epatica poiché abbiamo recentemente osservato una rapida induzione di cellule T CD8 spike-specifiche di SARS-CoV-2 da parte del vaccino mRNA BNT162b2[ ]. Infatti, utilizzando un tetramero HLA-A*03 abbinato al paziente caricato con un epitopo SARS-CoV-2-spike (S378-386) abbiamo identificato cellule T CD8 spike-specific. Nel sangue periferico, le cellule T CD8 spike-specific erano 10,2 volte più abbondanti delle cellule T specifiche per un epitopo di controllo delle cellule T CD8+ specifico per EBV (Suppl. Fig. 1). Abbiamo anche identificato cellule T CD8 spike-specific nel fegato. Rispetto al sangue periferico, il pool di cellule T CD8 intraepatiche era ∼3,4 volte arricchito per le cellule T CD8 specifiche dello spike (Fig. 3C) e mostrava caratteristiche di residenza tissutale (CXCR6, CD103, CD69) e una forte attivazione come indicato dall’espressione di CD38 (Fig. 3C). La proteina Spike non è stata identificata nel fegato al momento dell’analisi mediante immunoistochimica (dati non mostrati). Abbiamo poi chiesto se la frequenza e il fenotipo attivato delle cellule T CD8 spike-specifiche circolanti fossero mantenuti durante la terapia. È interessante notare che le analisi longitudinali hanno mostrato frequenze stabili di cellule T CD8 spike-specifiche circolanti (Fig. 3D) con livelli di espressione CD38 decrescenti dopo l’inizio della terapia con budesonide e in coincidenza con livelli di transaminasi in diminuzione. Tuttavia, l’espressione di CD38 su cellule T CD8 spike-specific e altri marcatori associati alla citotossicità come GzmB e T-bet è aumentata quando il paziente ha avuto una recidiva sotto terapia con budesonide, quindi normalizzata dopo l’introduzione della terapia immunosoppressiva sistemica (Fig. 3E-G). Questo modello non è stato osservato per LMP-1419-427-caricato HLA-A*24:02-restricted EBV-specifiche T cells (Supp Fig 1). Inoltre, non è stato osservato per le analisi di massa delle cellule T CD8, che tuttavia hanno mostrato un’elevata abbondanza di popolazioni di cellule T CD8 citototossiche attivate nella periferia (Fig. 3E-G). In sintesi, questi dati indicano un’ampia attivazione delle cellule T CD8 citotossiche con il fenotipo periferico delle cellule T CD8+ spike-specific che riflettono il modello di risposta clinica alla terapia immunosoppressiva.
 
Figura 3L’immunofenotipo delle cellule T CD8 periferiche e vaccinate è correlato alla gravità dell’epatite. A: Rappresentazione t-SNE dei dati della citometria a flusso che confrontano le cellule T CD8+ non naïve 27 giorni dopo la vaccinazione boost (dpb) nel fegato del paziente (rosso) e nel sangue (blu). Sono indicati i livelli di espressione di CXCR6, CD69, CD103 e CD38 (blu: bassa espressione; rosso: alta espressione). B: Livelli di espressione quantificati di CD38, 27 dpb su cellule T CD8+ non naïve all’interno del fegato (rosso) e del sangue (blu) del paziente rispetto ai vaccinati abbinati al time-point senza sviluppo di epatite. C: Grafici bivariati originali che mostrano frequenze di cellule T CD8+ specifiche (A*03/S378) specifiche per picco all’interno della popolazione di cellule T CD8+ a 27 dpb, fegato (rosso) e sangue (blu). Sono indicati i livelli di espressione di CXCR6, CD69, CD103 e CD38 di cellule T CD8+ specifiche per spike. D: Analisi longitudinale delle frequenze delle cellule T CD8+ specifiche del picco ex vivo calcolate. E: L’analisi longitudinale di CD38, F: Granzyme B (GrzB), G: Tbet+CD38hi CD8+ T cells sono mostrate con livelli ALT (U/l) abbinati nel tempo rappresentati in grigio con punti collegati, cellule T CD8 non naïve non naïve specifiche per spike (cerchio blu) e cellule T CD8 di massa non naïve (cerchio aperto grigio). Lo sfondo colorato indica il regime terapeutico del paziente (arancione: budesonide, rosso: prednisolone).
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Discussione

[6], [7], [10] La malattia autoimmune-simile all’epatite dopo la vaccinazione contro SARS-CoV-2 è ora riconosciuta come un evento avverso raro non identificato nei primi studi. L’uso diffuso del vaccino con la somministrazione di centinaia di milioni di dosi in tutto il mondo solleva anche questioni di causalità vs coincidenza. In particolare, la malattia simile all’AIH dopo la vaccinazione è stata riportata in pazienti con caratteristiche di età e sesso tipiche dell’AIH spontanea. Mentre alcuni di questi casi possono quindi rappresentare una coincidenza, è anche possibile una relazione causale con il vaccino, come l’epatite degli astanti guidata dall’elevazione delle citochine sistemiche o delle chemochine dopo la vaccinazione, simile ai casi che si verificano in associazione con l’infezione naturale da SARS-CoV-2. [13] I diversi modelli di manifestazione clinica e l’ampio intervallo di tempo trascorso tra la somministrazione del vaccino e l’insorgenza dei sintomi suggeriscono chiaramente che meccanismi diversi possono contribuire a questi casi segnalati. Qui, la nostra analisi evidenzia che le cellule T CD8 citotossiche attivate, comprese le cellule T CD8 spike-specifiche indotte dal vaccino, potrebbero contribuire alla patogenesi della malattia. [16]È quindi importante differenziare l’AIH dall’epatite immuno-mediata potenzialmente transitoria dopo la vaccinazione. La diagnosi di epatite autoimmune è tipicamente stabilita utilizzando strumenti di punteggio AIH informati da test di funzionalità epatica, sierologia auto-anticorpale e caratteristiche istologiche tipiche come l’epatite di interfaccia e l’arricchimento delle plasmacellule. [14] È importante sottolineare che l’epatite autoimmune è una condizione che richiede una terapia immunosoppressiva per tutta la vita in molti pazienti affetti. Nel nostro caso, prima della terapia, la diagnosi di AIH è stata ritenuta “probabile” sulla base del punteggio AIH originale modificato. È importante notare in questo contesto che il primo episodio di epatite acuta dopo la prima dose di vaccino è stato autolimitante senza terapia, il che ha anche guidato la nostra scelta di iniziare la terapia con budesonide nel tentativo di ridurre al minimo gli effetti collaterali sistemici e di mantenere l’immunità sistemica anti-SARS-Cov2, se possibile. Tuttavia, il nostro paziente ha avuto una ricaduta 3-4 settimane dopo la terapia con budesonide e quindi ha richiesto una terapia steroidea sistemica, che è stata empiricamente combinata con acido ursodesossicolico, una combinazione utilizzata nella terapia della sindrome da sovrapposizione dell’epatite autoimmune che è stata scelta a causa della presenza di anticorpi AMA-M2 tipicamente presenti nella colangite biliare primaria. [17] Il paziente si è successivamente ripreso rapidamente, con solo una gengivite che si è verificata durante la terapia steroidea sistemica come possibile evento correlato all’immunosoppressione. A causa dell’epatite recidivante dopo la riduzione degli steroidi, il paziente è stato sottoposto a terapia immunosoppressiva di mantenimento a lungo termine in base alla quale ha raggiunto la remissione biochimica completa. [15] Meccanicamente, la manifestazione della malattia nel nostro paziente era distinta dalla classica AIH spontanea, che è tipicamente associata a immunoglobuline periferiche elevate, un infiltrato dominato dalle plasmacellule e un’epatite di interfaccia prominente. Qui, mentre c’è stato un leggero aumento delle immunoglobuline periferiche e un arricchimento intraepatico delle cellule B intraepatiche e delle plasmacellule, è stato osservato un correlato più sorprendente a livello di cellule T CD8 citotossiche. Le cellule T CD8 citotossiche attivate sono state fortemente arricchite nel fegato del paziente in misura tale da rappresentare la più abbondante popolazione di cellule immunitarie intraepatiche e includendo risposte specifiche del vaccino SARS-CoV2. In particolare, lo stato di attivazione periferica di queste cellule T CD8 spike-specific è correlato alla gravità dell’epatite e al decorso clinico dopo l’introduzione della terapia immunosoppressiva. Questi risultati implicano le cellule T come un tipo di cellula immunitaria patogena chiave di questa epatite immunitaria associata al vaccino come un nuovo sottotipo di epatite autoimmune. L’aumento precoce dei valori di ALT dopo la prima e la seconda dose di BNT162b2 e l’osservazione che le cellule T CD8, comprese le cellule T CD8+ spike-specific, dominano l’infiltrato immunitario si adatta anche a recenti osservazioni che dimostrano una mobilizzazione precoce delle cellule T CD8 spike-specific già dopo la prima dose del vaccino [Da notare che il nostro reagente tetramero probabilmente colora solo una frazione delle cellule T antigene-specifiche indotte dalla vaccinazione, adattandosi all’ampia espressione dei marcatori di attivazione e citotossicità delle cellule T osservati nell’analisi della popolazione di cellule T CD8 di massa. Tuttavia, è anche possibile che l’ampio modello di attivazione osservato coinvolga altre popolazioni di cellule T CD8 “astanti” non specifiche per SARS-CoV2. Inoltre, il meccanismo preciso che causa l’infiltrazione delle cellule T CD8 spike-specific nel fegato che adottano caratteristiche delle cellule T di memoria residente nei tessuti (TRM) rimane poco chiaro. Le cellule T CD8+ specifiche del virus possono accumularsi nel fegato anche se il sito primario di infezione è distante, come durante l’infezione influenzale ed è possibile che il fegato possa agire come un “cimitero” per le cellule T attivate [18] , [19] Tuttavia, le cellule T CD8 citotossiche attivate possono mediare l’epatite anche in assenza di antigene [20] Inoltre, la citotossicità innata delle cellule T astanti indipendente dal TCR è stata descritta nelle infezioni acute [21], [22]. Da notare, le cellule CXCR6 + CD8 + TRM, come quelle presenti in questo paziente, possono mediare l’auto-aggressione nelle malattie metaboliche del fegato, in risposta a segnali infiammatori locali [23], [24]. Mentre questi rapporti sollevano la possibilità di un’epatite mediata da cellule T antigene-indipendenti, un’altra possibile spiegazione potrebbe essere la presenza del loro antigene affine, cioè la proteina spike. Mentre non siamo riusciti a rilevare la proteina spike da IHC nel fegato, va notato che la biopsia è stata eseguita 27 giorni dopo la seconda dose di vaccino e l’espressione transitoria dopo la vaccinazione, che avrebbe potuto causare cellule T CD8 spike-specific che esprimono CXCR6 a casa del fegato e cellule che presentano l’antigene bersaglio, non possono essere escluse. Tuttavia, meccanismi aggiuntivi, come il riconoscimento incrociato dell’antigene, possono anche contribuire all’immunopatologia. In sintesi, il vaccino BNTb163b2 può innescare l’epatite immuno-mediata da meccanismi legati all’immunità cellulare indotta dal vaccino. Questo caso illustra l’induzione di un’insolita epatite autoimmune a predominanza con cellule T CD8 dopo la vaccinazione con mRNA BNT162b2, con arricchimento delle cellule T CD8 specifiche sars-Cov2 indotte dal vaccino. Nei pazienti con epatite che si manifesta dopo la prima dose di vaccino, dosi aggiuntive possono innescare una significativa autoimmunità epatica e richiedere una soppressione immunitaria a lungo termine.

Metodi

Campioni di pazienti

Un uomo di 52 anni e 3 operatori sanitari (tutti HLA-A * 03: 01, confermato da NGS) >26 giorni dopo la vaccinazione boost che hanno ricevuto il vaccino a mRNA BNT162b2 sono stati reclutati presso l’University Medical Center freiburg, in Germania. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti. Inoltre, 5 campioni di tessuto epatico sano (tessuto a distanza di metastasi del fegato del cancro del colon-retto) sono stati ottenuti dall’Istituto di patologia chirurgica di Friburgo. Lo studio è stato condotto secondo le linee guida federali e i regolamenti del comitato etico locale (Albert-Ludwigs-University Freiburg, Germania; voto: # 21-1135 e # 21-1372) e la Dichiarazione di Helsinki (1975).

Citometria di massa per immagini

Il tessuto epatico è stato ottenuto mediante biopsia transcutanea, fissato con formalina, incorporato in paraffina, tagliato in sezioni da 4 μm e colorato come descritto in precedenza. [25] In breve, dopo la deparaffinizzazione, la reidratazione, il recupero e il blocco dell’antigene, i vetrini sono stati colorati con anticorpi marcati con metalli e asciugati all’aria. Acquisizione immagine della biopsia (30.912 mm2) e 2,25 mm2 dei campioni di controllo è stato eseguito utilizzando un Hyperion Imaging System (Fluidigm; STATI UNITI). I ROI erano ablati al laser punto per punto a 200 Hz, con una risoluzione in pixel di 1 μm2. La visualizzazione delle immagini è stata eseguita con FIJI (v1.52p, ImageJ). La segmentazione delle singole celle è stata condotta utilizzando una pipeline di analisi adattata e imparziale e supervisionata utilizzando Ilastik (v 1.3.3) e CellProfiler (v 3.1.9). Per analizzare le zone epatiche, la distanza di ciascun pixel da GLUL, CD34 e α-SMA è stata calcolata utilizzando CellProfiler (v 4.0.4), aggiunto alle informazioni ad alta dimensione di ciascuna cellula e utilizzato per il gating in OMIQ (Omiq Inc). Sono state definite zone epatiche: centrilobulare (distanza da GLUL ≤50μm), periportale (distanza da GLUL >50 μm e distanza da CD34 e α-SMA ≤50 μm) e intermedia (distanza da GLUL >50 μm e distanza da CD34 e α-SMA >50 μm). La conta cellulare assoluta è stata normalizzata a 1 mm2. I barplot impilati sono stati creati con R versione 4.0.1 utilizzando ggplot2.

Isolamento PBMC

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate da campioni di sangue anticoagulato dopo centrifugazione con gradiente di densità e successivamente conservate a -80 ° C fino a un ulteriore utilizzo.

Sospensione unicellulare da biopsia epatica

Il tessuto epatico rimanente è stato omogeneizzato meccanicamente e filtrato attraverso un filtro cellulare da 70 μm (Corning). Le cellule sono state lavate e trattate direttamente per l’analisi della citometria a flusso. Inoltre, anche i PBMC appena isolati sono stati colorati e analizzati mediante citometria a flusso.

Analisi di cellule T CD8+ spike-specifiche

PEPTIDE SPIKE SARS-CoV-2 (S378-386: KCYGVSPTK) è stato sintetizzato con una purezza di >70% (Genaxxon Bioscience, caricato su HLA-A*03:01 easYmers® (immunAware) e successivamente coniugato con fioceritrina (PE)-streptavidina (Agilent) secondo le istruzioni del produttore. Spike (A * 03 / S378)-specifiche cellule T CD8+ sono state analizzate dopo arricchimento magnetico a base di perline come descritto in precedenza.10 In breve, i PBMC sono stati incubati con S tetramerizzato coniugato con PE378-386-caricato HLA-A* 03:01 easYmers. Allo stesso modo, le cellule T CD8+ specifiche per EBV sono state rilevate utilizzando LMP-1 tetramerizzato coniugato con PE419-427-caricato HLA-A* 24:02 easYmers. Le cellule T CD8+ specifiche per virus sono state arricchite dalla tecnologia MACS utilizzando perline anti-PE. Successivamente, sia i campioni arricchiti che quelli pre-arricchiti sono stati analizzati mediante citometria a flusso multiparametrica. Le frequenze delle cellule T CD8+ specifiche per spike sono state calcolate come descritto in precedenza10,11. Campioni arricchiti con meno di 5 cellule T CD8+ specifiche del virus sono stati esclusi dall’analisi finale, con un conseguente limite di rilevamento di 5*10-6 cellule T CD8+ specifiche del virus.

Citometria a flusso multiparametrica

Gli anticorpi sono stati utilizzati per l’analisi della citometria a flusso. FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Fisher) e Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences) sono stati utilizzati rispettivamente per molecole intranucleari e citoplasmatiche. Dopo la fissazione delle cellule nel 2 % di paraformaldeide/PBS (Sigma), l’acquisizione è stata eseguita su LSRFortessa (BD). I dati sono stati analizzati con FlowJo, LLC (BD).

Riduzione dimensionale dei dati della citometria a flusso multiparametrica

Riduzione della dimensionalità condotta con R versione 4.1.1 utilizzando Bioconductor (release 3.13) CATALYST (Version 1.16.2). Le analisi sono state eseguite su cellule T CD8+ vive non naïve compresi i marcatori CD137, CD39, CD38, CXCR3, CD127, CXCR6, PD-1. È stato eseguito il downsampling a 45000 celle. Le intensità dei marcatori sono state trasformate da arcsinh (seno iperbolico inverso) con un cofattore di 150. La riduzione della dimensionalità sui dati trasformati è stata ottenuta da t-SNE.

ELISA

Gli anticorpi spike-binding sono stati valutati da Anti-SARS-CoV-2-QuantiVac-ELISA (IgG) (Euroimmun) rilevando S1 IgG (<25,6 BAU/ml: negativo; 25,6-35,1 BAU/ml: marginalmente positivo; ≥35,2 BAU/ml: positivo) secondo le istruzioni del produttore.
 

Dichiarazione di disponibilità dei dati

I set di dati di citometria a flusso e citometria di massa di imaging generati saranno resi disponibili in conformità con le normative legali su richiesta ragionevole.

Fonti di finanziamento

Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero federale tedesco dell’Istruzione e della Ricerca (01KI2077 a MH e RT) e della Fondazione tedesca per la ricerca (272983813 a BB, TB, RT, MH e CNH; 256073931 a BB, RT, MH e CNH; 413517907 a HL, 378189018 a BB). HL e MS sono supportati dal programma IMM-PACT per scienziati clinici, Dipartimento di Medicina II, Medical Center – Università di Friburgo e Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) – 413517907. Tb e SM sono supportati dal Berta-Ottenstein-Programme for Clinician Scientists, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo. Il lavoro di MH è ulteriormente supportato dalla borsa di studio Margarete von Wrangell (Stato del Baden-Wuerttemberg).

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Contributi degli autori:

Concetto di studio e design (TB, MH, BB); esperimenti e procedure (BC, HS, HL, LW, ESA, KZ, LK, MS); reclutamento di campioni di pazienti (TB, BB), valutazione istologica (CM,PB), bioinformatica e analisi statistica (BC, HS, HL, ESA); interpretazione dei dati e redazione del manoscritto (TB, MH, BB); revisione del manoscritto per importanti contenuti intellettuali (MP, CNH, RT);

Riconoscimenti

Ringraziamo il paziente per aver donato campioni e Saskia Killmer e Marilyn Salvat Lago della struttura di citometria di massa di Friburgo per l’eccellente servizio tecnico.
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